多糖多酚植物RNA提取的利器

許多植物由于未能有效地分離純化出其組織中的RNA， 而阻礙了其分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展。比如Northern雜交分析，體外翻譯分析或建cDNA文庫，RT-PCR及差異顯示分析等研究，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，提取純度高、完整性好的RNA是順利進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵所在。

酚類化合物的干擾

許多植物組織特別是果實（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）及樹木類植物中富含酚類化合物。隨著植物的生長，酚類物質(zhì)的含量也會增加，因此幼嫩的植物才是*的提取材料。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量要比落葉植物的葉子中高很多。

植物材料經(jīng)過前期的破碎處理后，酚類物質(zhì)會釋放出來，氧化（見下圖）后處理液變?yōu)楹稚?，并隨氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browning effect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失，而在用苯酚、氯仿抽提時，RNA還會丟失或形成不溶性復(fù)合物，從而影響RNA的分離純化。Newbury等還發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易與材料中酚類化合物總量之間并無直接相關(guān)性，而是與所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）有關(guān)。

次級代謝產(chǎn)物的干擾

許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性RNA的分離。因不能確定這些次級產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，所以，目前還沒有什么特殊的方法來*解決這個問題。

次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生過程

小結(jié)

植物組織特別是高等植物組織，組成成分復(fù)雜多樣，因此植物組織RNA的提取相對于其它生物材料來說要困難的多。因此單一試劑確實很難將植物組織提取中的所有問題都很好解決，因此這就需要有專門的科研人員或試劑生產(chǎn)商投入大量的精力和財力進(jìn)行深入的研究，進(jìn)而開發(fā)出方便實用的試劑盒來。

縱觀上RNA提取的試劑盒，如常見的TRIzol，以及一些的RNA提取試劑盒均很難從多糖多酚的植物中提取高質(zhì)量的RNA。

 Trizol主要成份是異硫氰酸胍和苯酚，沒有特殊去除多糖和多酚的試劑，所以對于大多數(shù)多糖多酚的植物無法成功提取，即使添加了如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸之類的防止酚氧化的試劑也很難提取。RNeasy Plant Mini Kit主要裂解液是鹽酸胍或則異硫氰酸胍，有些公司進(jìn)行改進(jìn)之后添加了諸如PVP40等結(jié)合多酚的試劑，亦無法取得讓人滿意的結(jié)果。

百泰克公司在RNA提取方面積累了豐富的實踐經(jīng)驗，開發(fā)出通用植物總RNA快速提取試劑盒（貨號：RP3301或RP3302），使客戶幾乎不需要再查很多相關(guān)的資料，不需要花很多的時間和精力去尋找提取合適植物樣品的試劑盒！在百泰克所試驗的一百多例多糖多酚植物中，無一例外地提取出來高質(zhì)量的RNA，其中包括棉花、蘋果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、番茄果實、茄子、松針、楊樹、擬南芥種子、菠蘿蜜、馬蹄金、早熟禾、高羊茅、云杉、松樹、紫椴、花楸、白樺、山毛櫸、海棠花、槭槭、紫羅蘭、毛爪草、丁香、月季、天竺葵、仙客來、菊花、牽?；?、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕等。

通用植物總RNA快速提取試劑盒特點(diǎn)如下：

l           高品質(zhì)的進(jìn)口吸附膜  極大程度上減小了其它進(jìn)口或國產(chǎn)吸附膜所造成的柱與柱之間吸附能力的差異，保證實驗的重復(fù)性

l           *的結(jié)合抽提液  性能穩(wěn)定、純度高，可極大程度提高結(jié)合效率，從而為RNA的得率打下良好的基礎(chǔ)

l           離心柱型  簡便快捷，不需要再采用傳統(tǒng)的異丙醇沉淀和乙醇洗滌，簡化操作步驟，提高實驗效率。同時也可避免提取物過渡干燥不易溶解的問題

l           自主研發(fā)漂洗液   可以有效消除基因組污染，提高RNA純度

多糖的干擾

多糖是植物RNA提取時另一常遇問題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開。

如果要去除多糖，RNA也會隨機(jī)被帶走，造成RNA得率降低；而沉淀RNA時，也往往產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液，所以也很難有效地將其與RNA分開。另外多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提也可以除去一些多糖；此外還可以通過LiCl沉淀RNA將部分多糖留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時多糖污染的問題。

RNA提取的常見難點(diǎn)

研究表明，一些植物組織之所以比較難提取出高質(zhì)量的RNA與這些植物組織中富含的一些成份有關(guān)，常見的有酚類化合物，多糖以及某些尚無法確定的次級代謝產(chǎn)物，另外還有就是富含較高活性RNase的組織。在完整的細(xì)胞內(nèi)，這些物質(zhì)與核酸是分離的，一旦細(xì)胞破碎，這些物質(zhì)就會與RNA相互作用。